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构建全长cDNA文库或全长均一化cDNA文库

 
技术简介:

  cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板,逆转录形成的互补DNA(cDNA)与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中,在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因,因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞或组织特异表达的基因。cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。
  经典cDNA文库构建的基本原理:用Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括:(1)mRNA的提龋获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。(2)cDNA第一条链的合成。(3)cDNA第二条链的合成。(4)双链cDNA的修饰。(5)双链cDNA的分子克拢(6)cDNA文库的扩增。(7)cDNA文库鉴定评价。
 
服务内容:

   科赛特科技有限公司拥有一批优秀的文库构建专业技术人员,可以提供标准化cDNA文库构建以及EST测序和分析服务,可以针对动物、植物、微生物等的组织和细胞等材料进行文库构建(普通cDNA文库、全长cDNA文库和均一化cDNA文库)。

(1)普通cDNA文库(质粒文库、噬菌体文库)构建
        文库特点:
        A.材料用量少,只需要1mg的Total RNA。
        B.采用Clontech SMART专利技术,技术成熟,全长比率高。
(2)均一化文库构建
       均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施,有利于研究基因的表达和序列分析。我们基于双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)的先进cDNA文库均一化技术构建均一化cDNA文库,能减低高丰度表达基因100倍以上,有效富集低丰度表达基因。
   文库特点:
   1.无需反复杂交过程,均一化程度高。
   2.均一化后平均插入片断大小无明显变化。 
(3)全长文库构建
    利用公司专有技术和专门试剂盒,进行全长文库构建服务。尤其适合希望获得高比例全长基因的客户。
   文库特点:
   1.不经过PCR过程,容易获得低丰度基因
   2.全长比例高(全长比例>80%)
   3.样品用量大,需要25mg的mRNA,因此,不适合样品量少的材料。
客户须知:
  1. 客户须在实验开始前确保其提供材料的数量和质量,并提供相关信息。
   客户可提供组织(200~1000μg)、细胞(106)或总RNA (>1μg ),请务必保持样品新鲜,RNA无任何降解,植物材料应避免过老的组织,尽量用柔嫩部位,以确保文库质量。同时请尽量提供物种基因组背景资料信息,如:基因组大小,基因平均长度,预计表达的基因数量等等。
  2. 本公司在收到客户提供的研究材料后会在第二个工作日起开始服务工作。
  3. 工作完成后,本公司会将结果及时发给客户,同时根据客户要求处理相关材料。 
  
服务承诺:
  1. 本公司将在保证质量的前提下,在最短的时间内完成实验。
  2. 本公司保证检测结果准确、客观、可信。
  3. 公司将对所有技术服务相关材料信息保密,并会在服务完成后按客户要求对相关材料进行合理处理。
  
服务周期:
   实验周期一般为得到合格的总RNA后15~45个工作日。
  1. 从客户提供的材料中提取高质量的mRNA。
  2. 根据客户需求构建普通cDNA文库、全长cDNA文库和均一化cDNA文库。 

文库构建优惠报价:
   cDNA文库构建:1-3万元人民币
   全长cDNA文库构建:3.0-5.0万元人民币
   均一化cDNA文库构建:3.5-6万元人民币
  
  cDNA测序:
   ≥10,000条序列 20元/条
   5,000-10,000条序列 25元/条
   ≤5000条序列 30元/条

  信息服务:1.5-4.0万元
   基本信息服务:从峰图到序列的转化,控制低质量,去除载体序列;序列拼接;EST注释;ORF预测及分析;利用 nr,nt数据库进行注释。
   高级信息服务:代谢途径分析;功能蛋白分析;Interpro功能域分析;序列属性及其对应unigene分析;COG分析;EST相关网络数据库构建。
 
交货内容:
  A. 产物电泳图谱;
  B. 初始库,保存在-20℃;
  C. 文库评价数据,包括库容量,插入片段平均长度,重组效率,cDNA完整性评价等。
   技术指标:库容≥1.0×106,insert≥400 bp,平均 insert≥1.3Kb
  D. 实验报告(包括实验流程,材料和方法等)。
  4. 客户应对所提供的材料及信息负责,如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或
 
问题解答:
 
  1、问:为什么要建cDNA文库?cDNA文库有什么优点?
 
   答:基因作为基因组上具有功能作用的单位在生物研究中具有极其重要的地位,生物的多样性和相似性与基因之间的变异和同源密切相关, 基因的克隆可以直接应用于后续的功能研究,能产生不可估量的经济价值。研究基因最好的方法是获得全长基因,而真核基因组一般都很庞大,其内部有大量的内含子,导致一个基因动辄数十到数百kb长,因此很难获取完整基因的克隆; 而且从基因组水平上很难反映个体间或组织间特定基因表达的差异。mRNA是由酶切除了内含子得到的基因外显子组装而成,是可表达的基因的最简化形式。 从mRNA构建cDNA文库就可以非常方便的获取生物个体或特定组织的所有基因的集合,对其测序,得到大量基因信息; 也可以根据已有信息筛选基因。由于RNA很容易被无处不在的RNA酶降解,在mRNA基础上构建cDNA文库,实验操作上比较复杂,耗时且耗资较多,但是有其它方法无法替代的优势:
   1) cDNA文库中包含建库材料中几乎所有的基因,可以作为后期长时间研究的一个基因库,是基因后续功能研究的基础。
   2) 对cDNA文库进行大规模测序,可以获取大量新基因,研究特定功能基因的表达水平,对成果申请专利保护。
   3) 可以通过Southern杂交、PCR或其它方法从cDNA文库中调取基因,进行研究。
   4) 可以对同种组织表型差异的cDNA文库测序,比较它们之间相似基因的差异表达,并进行后续试验验证,从而得到与表达差异相关的功能基因。
   5) 可获取全长基因的序列,连接到表达载体上表达出蛋白,再进行后续相关研究。
 
   2、问:有多少种类的cDNA文库?
 
   答:根据建库的目的分为:表达文库和非表达文库;根据载体类型分为:质粒载体的cDNA文库和噬菌体cDNA文库;此外还有均一化cDNA文库, 其构建目的是降低文库中高丰度基因的丰度,减少测序中反复测到高丰度基因的频率。
   我们公司可以构建标准和全长非表达的质粒cDNA文库。
 
   3、问:为什么要进行cDNA克隆测序? 你们公司有什么优势?
 
   答:尽管核酸杂交分析能够测定出基因组克隆中基因间隔序列的位置,然而更精确的结果, 要通过比较基因组上的基因同其mRNA转录本在核苷酸序列上的差异才能确定。另外,mRNA 5’末端和3’末端的精确序列结构.也只有通过测序才能获得。因此, cDNA克隆测序可以有效的分析外显子的结构; 在已知基因组序列的情况下,通过和cDNA序列比较,还可以明确内含子和外显子的界线。
   我公司在测序方面有如下特点:
 
  1) 在cDNA克隆测序方面有丰富的数据积累:100万条猪EST、10万条家蚕EST,以及更多的万千数量级项目。
   2) 数据分析量身定做。
   3) 我们在操作中用了EcoR I和Xho I双酶切.使cDNA链可以定向插入载体,故您的测序目标就变得明确和易于掌控。
 
   4、问:为什么要构建全长文库?
 
   答:传统方法构建的cDNA文库由于方法上的局限性,文库中的大部分cDNA序列不是全长的,当您从库中找到感兴趣的基因, 再想获取它的全长序列时,传统方法是要进一步做5’和3’RACE来得到,而这种实验既复杂难做又耗资多。我们公司采用SMART技术,从实验原理上保证了构建的就是全长cDNA文库,可以得到的大部分基因为全长基因,从而减少实验步骤和花费; 而且现在全长文库与传统文库的价格相差不大,做全长cDNA文库是一举两得的好办法。
 
   5、问:如何从少量细胞制备合格的cDNA文库?
 
   答:有时候含有目的基因的组织和细胞不易得到,这些起始材料的缺乏要求采用特殊的方法来构建合格的cDNA文库:
   1) 使用新鲜采集的材料并立即提取mRNA, 或者放到-70℃冻存于含RNA酶抑制剂的裂解液中直到收集到足够多的材料;
   2) 根据材料的量按比例降低提取RNA的试剂用;
   3) 使用核酸载体降低表面吸附造成的材料损失,或提高乙醇沉淀mRNA的速度和效率;
   4) 用总RNA作为cDNA一链合成的模板;
   5) 在一链合成、二链合成以及接头的连接过程中只使用一种缓冲液;
   6) 用PCR扩增一链或二链;
   7) 省略甲基化步骤;
   8) 用柱层析替代电泳对cDNA按大小进行分级分离;
   9) 用预实验确定连接反应中cDNA与载体的最佳比例。(以上参见分子克隆Ⅲ)
 
  6、问:什么情况下可以进行cDNA扩增?
 
   答:我们不建议随意扩增cDNA文库,因为哪怕是仅仅一轮的扩增也会破坏mRNA在cDNA文库中的代表性,只有在下列情况下,选择扩增是合适的:
   1) 库容量变小。
   2) 目的基因的mRNA表达丰度在组织中极低,用正常手段很难筛选出来。
   传统构建cDNA文库的方法最难解决的问题就是样品量少且珍贵,我们现在使用SMART技术,从100mg样品中提取的RNA量就足以满足建库需求。从而大大提高了珍稀样品建库的成功率。
 
   6、问:如何提高对cDNA文库的测序效率,减少反复测到同一个基因,而获得更多的Unigene?
 
   答:我们公司使用特殊的酶处理方法,利用动力学原理构建的全长均一化文库可以将文库中高拷贝基因的丰度降低到和低拷贝基因同等的丰度,大大增加了测序发现低丰度基因的频率,从而发现那些最有价值的稀有基因。

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