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大片段DNA的测序

大片段DNA的测序

■ 鸟枪法 (Shot Gun Sequencing) 测序
◇ 鸟枪法测序的操作方法
1. 对预测序的DNA用物理方法进行切断处理,然后用T4 DNA Polymerase对小片段DNA进行末端平滑化。
2. 进行Agarose电泳,切胶回收1 kbp ~ 2 kbp的小片段DNA。
3. 将回收的DNA片段连入平端载体中,然后转化,挑选克隆。
4. 对阳性克隆(含1 kbp ~ 2 kbp Insert)进行DNA测序。
5. 对数据进行编辑,最后连成一条大片段的DNA序列。
◇ DNA测序量
应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的5倍量进行计算,对每个反应的有效测序长度定义为500 Bases。如:对10 kbp的DNA片段进行测序时,可以按以下方法进行计算:
测序量=10,000 Bases×5/500 Bases=100个反应
◇ 结果编辑
按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序,然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段 (Contig)。
◇ 补缺工作
结果编辑工作结束后,会发现在数个DNA大片段(Contig) 间的序列没有测定,此时应该进一步通过技术手段,解析那些没有被解明的DNA序列,进行整体DNA序列的补缺工作。
◇ 收费标准
来样前请询价。
◇ 其他说明
1. 病毒DNA中,特别是病毒DNA的两端经常会有大片段的 DNA重复序列出现,可能无法测序,请理解。
2. DNA序列中,有时会有G、A、C、T的连续结构、G/C rich等复杂的立体结构出现,此部分有可能无法测序,请理解。
■ 限制酶切,亚克隆测序法
◇ 限制酶切、亚克隆测序法的方法
1. 选择适当的限制酶,对Insert DNA片段进行切断处理。
2. 对切断的DNA片段进行亚克隆。
3. 对每个亚克隆中的DNA片段进行测序。
4. 编辑测序结果。
5. 整体序列如有空缺,进行补缺工作。
◇ 收费标准
0.8 元/Base (含DNA测序费、引物合成费、克隆费、PCR反应费等)。
◇ 其他说明
1. 病毒DNA中,特别是病毒DNA的两端经常会有大片段的DNA重复序列出现,可能无法测序,请理解。
2. DNA序列中,有时会有G、A、C、T的连续结构、G/C rich等复杂的立体结构出现,此部分有可能无法测序,请理解。

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