BAC文库构建的技术支持:
材料
缓冲液和溶液
- 碱裂解液I , 4°C 50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-Cl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0) 配制碱裂解液I 约100ml,灭菌,保存在四度。
- 碱裂解液II,新鲜配置,室温保存 0.2 N NaOH (从10N的NaOH新鲜制备) 1% (w/v) SDS 碱裂解液II应该新鲜配制,室温保存。
- 碱裂解液III, 4°C 5M 醋酸钾,60ml 冰醋酸,11.5ml SDW,28.5ml
- 酒精 - 70%酒精 - 异丙醇 - 酚:氯仿(1:1, v/v) - 醋酸钠 (3M,pH5.2) - STE,4°C 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 0.1 M NaCl 1 mM EDTA (pH 8.0)
- TE (pH 8.0) 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0)
载体与菌株 BAC转化的大肠杆菌
培养基和抗生素 含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液体培养基
酶和缓冲液 溶菌酶 RNaseA,不含DNase 限制性内切酶和相应缓冲液
核苷酸/寡核苷酸 用于脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis)的DNA标准参照物
凝胶/点样缓冲液 脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gels,或者0.5%琼脂糖凝胶)
离心机/转头/离心管 其他 37摄氏度摇床
1. BAC DNA大量提取方案 (参考文献:Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition)
此方案适合从500ml的菌液中提取BAC DNA,一般可以产生20-25μg纯化的DNA。
方法
1. 将50μl BAC转化菌的过夜培养物接种到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中,37℃ 震荡(280rpm)培养12到16小时。
2. 2500g,4℃,离心15min,收集菌体。
3. 用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀。按步骤2方法离心收集细菌。
4. 用24ml含RNase(100μg/ml)的碱性裂解液I溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为1mg/ml。
5. 加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II。盖紧离心瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,冰裕5min。
6. 加入24ml冰预冷的碱性裂解液III,盖紧瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,置冰上5min。
7.15000g,4℃,离心10min,将上清转移到另一离心瓶中,弃沉淀。
8. 加等体积的酚:氯仿。轻轻翻转离心瓶数次,混匀。3000g,室温离心15min。
9. 将水相移至另一离心瓶中,加入等体积的异丙醇,翻转离心瓶数次,混匀。
10. 15,000g,室温离心15分钟,回收核酸沉淀。
11.弃上清,用20ml 70%乙醇漂洗沉淀。
12.弃乙醇,风干使乙醇挥发殆尽。
13.小心将BAC DNA沉淀溶于0.2ml TE (pH8.0) 中。
2. BAC DNA的小量提取 (参考文献:Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition)
此方案适合从5ml菌液中提取BAC DNA,一般可以产生0.1-0.4μg的BAC DNA。
方法:
1. 挑取单菌落接种至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中,37℃剧烈震摇过夜。
2. 2000g,4℃,离心5min,收集菌体。
3. 在每个离心管中加5ml预冷的STE,用移液器吹悬细菌沉淀。按步骤2离心收集细菌。
4. 将菌体重悬于200ul冰冷的碱性裂解液I中。将菌体转移至预冷的微量离心管中,置于冰上。
5. 向管中加入400μl新鲜配置的碱性裂解液II。轻轻翻转数次,将离心管置于冰上。
6. 向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液III,轻轻翻转数次。将离心管置于冰上5min。
7. 在微量离心机上以最大速度4℃离心5min,除去细胞碎片沉淀。将上清移入一新的微量离心管中。室温下加入900μl异丙醇,轻轻翻转数次离心管,混匀。
8. 立即在微量离心机上室温下最大速离心5min,使核酸沉淀。弃去上清,用1ml 70%乙醇小心漂洗。室温下离心2min,吸去乙醇。室温干燥沉淀5-10min后,将沉淀溶于50μl TE(pH8.0)中.、
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